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重组大肠杆菌发酵巨藻生物质合成丁二酸的研究; Efficient Production of Succinic Acid from Macroalgae Biomass by Recombinant Escherichia coli
白冰
学位类型硕士
导师邢建民
2015-05
学位授予单位中国科学院研究生院
学位专业生物化工
关键词丁二酸 大肠杆菌 巨藻生物质 Pep羧化激酶 甘露醇
摘要丁二酸作为一种重要的C4平台化合物,能够通过化学或生物转化合成许多高附加值的大宗化学品。微生物发酵法生产丁二酸具有反应条件温和,环境友好等特点,受到国内外研究人员的广泛关注。目前,丁二酸生物合成工业化的关键问题主要包括原料成本过高,菌株生产能力较低等。针对这些难题,本研究从构建高产丁二酸菌株出发,探讨大型藻类(巨藻)生物质作为新型碳源发酵生产丁二酸的可行性。 首先,敲除了野生型Escherichia coli W3110厌氧代谢中副产物途径的关键酶:乳酸脱氢酶(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflB),构建了菌株E. coli BS002。由于胞内氧化还原不平衡及丙酮酸积累等原因,该菌株在严格厌氧条件下无法利用葡萄糖。由于磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)在催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)至草酰乙酸(OAA)的反应过程中伴随ATP的生成,考虑到能量代谢的诸多优势,向E. coli BS002引入Actinobacillus succinogene 130Z PCK,构建了工程菌E. coli BS101 (△ldhA△pflB::Kan/ pTrcHisA-130Zpck)。摇瓶发酵结果表明E. coli BS101消耗8.14 g/L葡萄糖,积累4.77 g/L丁二酸和2.65 g/L丙酮酸,丁二酸得率达到0.88 mol/mol,较野生型E. coli提高约3倍,同时几乎不产生乳酸、甲酸和乙酸。 其次,研究酶的表达水平、HCO3-的供应方式以及浓度对于菌株生长和丁二酸合成的影响,优化PCK催化效率和胞内ATP的供给能力。摇瓶发酵结果表明,当IPTG浓度为0 mmol/L 和NaHCO3浓度为15 g/L时,PCK的催化能力最高,菌株的丁二酸产量和摩尔得率分别达到5.68 g/L和1.15 mol/mol,较之前提高约20%和28%。此外,通过进一步考察胞内ATP的供应强度,证实在最优条件下菌体胞内ATP的水平较未优化时提高近2倍。 此外,考察L. japonica为代表的巨藻生物质作为发酵碳源生产丁二酸。经过简单的预处理和酶解后,L. japonica水解液中主要包含10.31 g/L葡萄糖和10.12 g/L甘露醇。选择以E. coli BS002作为生产菌株,当甘露醇作为单一碳源时,丁二酸摩尔得率高达1.39 mol/mol,较葡萄糖作为碳源时提高近38 %。而且,水解液不需要进行脱毒处理,能够直接被用于菌体生长和丁二酸合成,但是菌株对于葡萄糖和甘露醇的利用过程中存在“diauxic”现象。最终,工程菌利用L. japonica水解液发酵产生17.44 g/L丁二酸、2.73 g/L丙酮酸和1.55 g/L乙酸,丁二酸总摩尔得率达到1.24 mol/mol总糖。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/20296
专题研究所(批量导入)
推荐引用方式
GB/T 7714
白冰. 重组大肠杆菌发酵巨藻生物质合成丁二酸的研究, Efficient Production of Succinic Acid from Macroalgae Biomass by Recombinant Escherichia coli[D]. 中国科学院研究生院,2015.
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