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超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究; Study on Gigaporous Chromatographic Process of Virus-like Particles Purification
于孟冉
学位类型博士
导师苏志国
2015-05
学位授予单位中国科学院研究生院
学位专业生物化工
关键词类病毒颗粒 超大孔色谱填料 乙肝表面抗原 填料孔径 结构稳定性 等温滴定量热法
摘要类病毒颗粒(Virus-like particles, VLPs)是一类用于传染性疾病预防的重要新型疫苗,有效的分离纯化是确保其安全性和有效性的关键。色谱分离是生物大分子分离纯化最主要的技术,商品化的色谱填料主要是为常规蛋白质设计,孔道一般小于30 nm,而VLPs通常由上百个亚基组装而成,尺寸在20~100 nm,因此其在传统填料中的扩散速率慢,甚至会堵塞孔道,导致分离时间过长,以及产物在操作中大量失活。为此,本论文研究孔径达到100 nm以上的新型超大孔色谱填料在乙肝表面抗原类病毒颗粒(Hepatitis B virus surface antigenVLPs,HB-VLPs)分离纯化中的应用,通过与其他类型色谱填料对比,对超大孔填料色谱分离VLPs的过程特点进行了如下系统的研究: (1)选取具有不用孔径的两种琼脂糖填料(DEAE-FF、DEAE-Capto),四种超大孔填料(DEAE-AP-120nm、DEAE-AP-280nm、POROS D和POROS HQ),以及一种整体柱类型的阴离子交换色谱填料,首先考察了孔径对不同尺寸的蛋白质动态载量的影响,发现小孔径的琼脂糖填料对较小尺寸蛋白的结合具有优势,而超大孔填料更适合于HB-VLPs超大分子的吸附,并且有助于获得更高的HB-VLPs抗原活性回收率。 (2)采用单孔和双孔分布模型,对琼脂糖填料和超大孔填料的孔结构进行准确表征。然后深入分析填料孔径对不同大小生物分子静态、动态吸附载量和吸附动力学的影响规律。结果表明,对于水力学半径小于5.4 nm的蛋白,填料的可及比表面积是影响吸附载量的主要因素;而对于水力学半径大于5.4 nm的蛋白,其吸附主要受到填料孔径的影响,大孔填料可以提供更大的可及比表面积和更快的传质速率。 (3)结合激光共聚焦检测、高效液相尺寸排阻色谱分析、以及投射电镜等方法,对HB-VLPs色谱分离过程中,填料孔径对VLPs结构和活性影响的机理进行了分析。VLPs在琼脂糖填料DEAE-FF和DEAE-Capto上的吸附仅限于外表面一薄层区域,而在超大孔填料DEAE-AP-120nm和DEAE-AP-280nm上则可以通过有效的扩散传质进入到孔内部空间,使HB-VLPs在DEAE-AP-280nm上静态吸附载量增加12.9倍,扩散速度提高11.4倍。尤其是超大孔结构还可以有效降低HB-VLPs与填料表面配基之间的多位点结合,避免亚基的解聚,使其结构稳定性得到了大幅度的提高。在2.0 mg/mL-media的进料量的情况下,大约85.5%的HB-VLPs经过DEAE-AP-280nm色谱之后是正确组装的结构,相反的是DEAE-FF由于不可逆的解聚VLPs,有85.2%的VLPs失去正常组装结构。在HB-VLPs实际纯化中,在2.98 mg protein/mL-media进料量,240 cm/h高流速下,经过DEAE-AP-280nm纯化后的抗原活性收率达到68.33%,纯化倍数高达3.47倍。 (4)建立了HB-VLPs在离子交换填料上吸附和发生亚基解聚的热力学模型,从热力学角度阐释填料孔径和配基密度对HB-VLPs吸附过程中结构稳定性的影响机理。微量热滴定技术与色谱实验结果相结合,得到HB-VLPs吸附和解聚过程相关的热力学参数。结果表明,完整的HB-VLPs在填料上吸附的本征摩尔吸附焓均为正值,表面吸附是熵驱动的吸热过程。而吸附过程中伴随亚基解聚产生的摩尔变构焓则均为负数,表明HB-VLPs解聚体的形成是一个焓驱动的自发过程。而且随着填料孔径的减小、或是配基密度的增加,构象变化焓越来越负,表明HB-VLPs亚基的解聚越易于发生。这一结果与色谱实验发现的HB-VLPs完整颗粒吸附过程中,随孔径减小或是配基密度的增加而解聚越严重的结果一致。 本文研究超大孔色谱填料分离纯化HB-VLPs的过程,对于建立高效的VLPs分离纯化工艺具有重要的指导意义。超大孔色谱填料应用于VLPs分离纯化,已经被证实不仅具有高载量、高传质速率的优势,而且从热力学方面可以提高VLPs在液固界面上的结构稳定性,从而保持高的生物活性,因此具有广泛的应用前景。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/20309
专题研究所(批量导入)
推荐引用方式
GB/T 7714
于孟冉. 超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究, Study on Gigaporous Chromatographic Process of Virus-like Particles Purification[D]. 中国科学院研究生院,2015.
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