大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究

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	大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究; Enhancement of fatty alcohol production in Escherichia coli with developed genome-editing method
	刘谊兰
学位类型	博士
导师	邢建民
	2015-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	生物化工
关键词	脂肪醇基因组编辑酯解酶脂肪酸饥饿合成生物学
摘要	脂肪醇广泛应用于化工、再生能源、医药等领域。近年来微生物发酵法生产脂肪醇的研究众多，已经初步实现了这类物质的可再生合成方法。然而，目前微生物发酵生产脂肪醇存在产量低、菌种改造缓慢、检测过程繁琐、代谢路径选择不合理等问题，严重制约了脂肪醇化合物的发酵法生产和工业化进程。本论文从化合物的理化性质、生理毒性、菌种改造手段、代谢路径优化等方面出发，提供了高效准确的基因组改造方法、简单快速的检测方法、构建了一系列脂肪醇高产的大肠杆菌工程菌，为实现大肠杆菌高产脂肪醇的“生物制造”奠定了基础。首先，本论文利用了大肠杆菌高频自发断裂和断裂后的同源重组修复机制，设计并实现了依靠正向重复序列辅助的大肠杆菌无痕编辑方法，命名为TRAGE。对可能影响TRAGE操作效率的因素（蔗糖加入节点、传代次数、传代时期）进行了系统考察，建立并优化了TRAGE操作流程，最终实现60小时内完成基因组的无痕编辑。其次，本论文利用正交试验优化了发酵液中脂肪醇和脂肪酸的提取方法，确定了提取条件，萃取剂是乙酸乙酯，溶剂和样品比例为1:2，摇床温度为10 ℃、转速260 rpm的条件下提取2 min。此外本论文建立了基于HPLC-RID的脂肪醇和脂肪酸的分析方法。利用C18色谱柱，流动相为甲醇:水：乙酸(90 : 9.9 : 0.1, v/v/v)，流速为1.0 mL/min。验证试验显示标品线性良好(r2 ≥ 0.9989)，日间和日内相对标准偏差分别小于4.46%和5.38%, 证明该方法具有良好的重复性和准确度。再次，本论文提出了采用诱发脂肪酸饥饿促进脂肪醇积累的思路，并证明了其可行性。在利用TRAGE敲除大肠杆菌所有已知酯解酶基因的基础上，过量表达外源脂酰-ACP还原酶，使脂肪醇的积累量较改造前增加了1.4倍。在此基础上，本研究通过敲除副产物合成路径，降低有毒副产物产生，将脂肪醇的产量提高至6.33 g/L。此外，本论文首次利用RBS计算手段辅助设计脂肪醇合成路径上的相关基因的RBS位点，利用所开发TRAGE完成了对fabH、 fabZ RBS区域的改造，最终结合发酵过程优化使得脂肪醇的产量达到9.35 g/L。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/20325
专题	研究所（批量导入）
推荐引用方式 GB/T 7714	刘谊兰. 大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究, Enhancement of fatty alcohol production in Escherichia coli with developed genome-editing method[D]. 中国科学院研究生院,2015.

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大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢（4136KB）	学位论文		开放获取	CC BY-NC-SA	浏览请求全文