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大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究; Enhancement of fatty alcohol production in Escherichia coli with developed genome-editing method
刘谊兰
Subtype博士
Thesis Advisor邢建民
2015-05
Degree Grantor中国科学院研究生院
Degree Discipline生物化工
Keyword脂肪醇 基因组编辑 酯解酶 脂肪酸饥饿 合成生物学
Abstract脂肪醇广泛应用于化工、再生能源、医药等领域。近年来微生物发酵法生产脂肪醇的研究众多,已经初步实现了这类物质的可再生合成方法。然而,目前微生物发酵生产脂肪醇存在产量低、菌种改造缓慢、检测过程繁琐、代谢路径选择不合理等问题,严重制约了脂肪醇化合物的发酵法生产和工业化进程。本论文从化合物的理化性质、生理毒性、菌种改造手段、代谢路径优化等方面出发,提供了高效准确的基因组改造方法、简单快速的检测方法、构建了一系列脂肪醇高产的大肠杆菌工程菌,为实现大肠杆菌高产脂肪醇的“生物制造”奠定了基础。 首先,本论文利用了大肠杆菌高频自发断裂和断裂后的同源重组修复机制,设计并实现了依靠正向重复序列辅助的大肠杆菌无痕编辑方法,命名为TRAGE。对可能影响TRAGE操作效率的因素(蔗糖加入节点、传代次数、传代时期)进行了系统考察,建立并优化了TRAGE操作流程,最终实现60小时内完成基因组的无痕编辑。 其次,本论文利用正交试验优化了发酵液中脂肪醇和脂肪酸的提取方法,确定了提取条件,萃取剂是乙酸乙酯,溶剂和样品比例为1:2,摇床温度为10 ℃、转速260 rpm的条件下提取2 min。此外本论文建立了基于HPLC-RID的脂肪醇和脂肪酸的分析方法。利用C18色谱柱,流动相为甲醇:水:乙酸(90 : 9.9 : 0.1, v/v/v), 流速为1.0 mL/min。验证试验显示标品线性良好(r2 ≥ 0.9989),日间和日内相对标准偏差分别小于4.46%和5.38%, 证明该方法具有良好的重复性和准确度。 再次,本论文提出了采用诱发脂肪酸饥饿促进脂肪醇积累的思路,并证明了其可行性。在利用TRAGE敲除大肠杆菌所有已知酯解酶基因的基础上,过量表达外源脂酰-ACP还原酶,使脂肪醇的积累量较改造前增加了1.4倍。在此基础上,本研究通过敲除副产物合成路径,降低有毒副产物产生,将脂肪醇的产量提高至6.33 g/L。此外,本论文首次利用RBS计算手段辅助设计脂肪醇合成路径上的相关基因的RBS位点,利用所开发TRAGE完成了对fabH、 fabZ RBS区域的改造,最终结合发酵过程优化使得脂肪醇的产量达到9.35 g/L。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/20325
Collection研究所(批量导入)
Recommended Citation
GB/T 7714
刘谊兰. 大肠杆菌基因组编辑新方法及其在脂肪醇代谢工程应用的研究, Enhancement of fatty alcohol production in Escherichia coli with developed genome-editing method[D]. 中国科学院研究生院,2015.
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