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葡激酶的聚乙二醇定点修饰产物制备及药学性质研究
薛晓莹
学位类型博士
导师胡涛
2015-05
学位授予单位中国科学院研究生院
学位授予地点北京
学位专业生物化工
关键词Peg修饰 葡激酶 空间屏蔽效应 生物活性 加热处理
摘要聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰可有效地提高蛋白质药物在体内的循环半衰期、降低药物对蛋白水解酶的敏感性和免疫原性。葡激酶(staphylokinase,SAK)是一种可用于治疗心肌梗死的新型溶栓制剂,它的作用底物纤溶酶原是一种生物大分子。SAK的体内循环半衰期较短,并且对人体具有较强的免疫原性,PEG修饰技术可以很好地解决葡激酶存在的这些临床缺陷。但是,PEG分子对蛋白质表面的空间屏蔽作用会影响蛋白质药物与其底物的相互作用,从而引起蛋白质药物的生物活性降低,这一问题在以生物大分子为作用底物的蛋白质药物中尤为严重。本研究以SAK作为模型蛋白,通过调节PEG与SAK之间的连接桥,改变PEG的构象及其对蛋白质的空间屏蔽效应,以期找到一种提高PEG化蛋白质生物活性的方法。 选择远离蛋白质的活性区域进行定点修饰是降低PEG分子对蛋白质活性影响的有效方法。本论文中所使用的SAK为重组蛋白,在远离其活性区域的C-末端引入了半胱氨酸残基。然后,通过3种不同的异型双功能小分子分别将一个PEG-20K共价连接在SAK的C-末端自由巯基上。制得的3种单一定点PEG化SAK具有基本相同的结构,唯一的差别在于PEG分子与SAK之间的连接桥。这3种连接桥为苯基、丙基和戊基,其中苯基代表刚性结构,丙基和戊基代表柔性结构(丙基和戊基可被视为不同长度的柔性结构)。圆二色光谱和荧光光谱检测结果表明,在这3种PEG修饰产物中,SAK蛋白质本身的结构均未发生明显变化。动态光散射和分析超离心检测结果显示刚性连接桥介导形成致密的PEG构象,PEG以紧致的结构覆盖于修饰位点附近;而柔性连接桥可介导形成疏松的PEG构象,PEG可以舒展地覆盖于SAK的表面。对于远离活性中心修饰的SAK,局部致密的PEG构象对SAK的空间屏蔽效应较小。对修饰产物的药学性质进行研究,发现局部致密的PEG构象既能有效地提高蛋白质的循环半衰期,降低药物对蛋白水解酶的敏感性和免疫原性,同时能更大限度地保持蛋白质的体外生物活性(比延展疏松的PEG构象高15 %)。 本研究进一步制备了6种SAK的单PEG修饰产物,分别涉及到了PEG的链长、修饰位点和PEG与蛋白质之间的连接桥这3种影响PEG修饰蛋白质的因素。将修饰产物在70 ℃下加热孵育2 h,进一步研究了PEG的构象及其与蛋白质的生物活性之间的关系。圆二色光谱和荧光光谱检测结果表明,较高的PEG分子量、远离活性区域、延展疏松的PEG构象在保护蛋白质结构方面更具优势。分析超离心研究结果显示加热作用使得PEG构象由延展疏松变为局部致密。这种构象转变使得通过戊基连接桥介导的PEG-20K修饰SAK产物中的PEG活性区域的屏蔽效应变小,相对生物活性升高(~ 27 %)。这个结果进一步说明了局部致密的PEG构象可降低PEG对蛋白质药物的空间屏蔽效应,提高PEG化蛋白质药物的生物活性。本研究的修饰策略可对其它以生物大分子为作用底物的蛋白质药物的PEG修饰方法提供借鉴。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/20341
专题研究所(批量导入)
推荐引用方式
GB/T 7714
薛晓莹. 葡激酶的聚乙二醇定点修饰产物制备及药学性质研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2015.
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