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基于聚多巴胺功能化的膜色谱介质制备及其在蛋白分离中的应用
樊金鑫
学位类型博士
导师万印华
2017-07
学位授予单位中国科学院研究生院
学位授予地点北京
学位专业生物化工
关键词膜色谱 膜色谱介质 聚多巴胺 Α1-抗胰蛋白酶 酶膜反应器
摘要

膜色谱结合了膜过滤高通量和液相色谱高选择性的特点,能够高效地从复杂料液如发酵液、血浆、乳清中获得纯度较高的生物活性分子,因此在生物产品制备领域具有广阔的应用潜力。然而,现阶段膜色谱介质(基膜材料)存在稳定性较差、机械性能欠佳及其制备工艺复杂、不易控制等问题。本研究采用简单易操作的聚多巴胺(PDA)涂覆对机械强度较高的微滤膜进行活化,然后以PDA为中间功能层偶联膜色谱配基构建多种膜色谱介质,并应用于蛋白分离纯化和酶的固定化。(1)通过将PDA涂覆于亲水性聚醚砜膜(PES)形成中间功能层,然后偶联三种不同的配基(聚乙烯亚胺、十二硫醇和组氨酸)制备阴离子交换、疏水和亲和膜色谱介质。处理免疫球蛋白G/人血清白蛋白(IgG/HSA)混合液时,通过阴离子交换膜色谱分离可获得纯度为96.7%的HSA;经过疏水膜色谱分离可获得纯度为94.6%的IgG;通过亲和膜色谱分离,可获得的纯度接近100%的IgG。同时经PDA改性,可有效提高膜介质的亲水性并降低其非特异性吸附。(2)通过将PDA涂覆于疏水性聚偏二氟乙烯膜(PVDF),对其进行亲水改性(膜表面接触角由原来的116°下降至61.3°),然后偶联聚丙烯胺配基制备得到耐盐型阴离子(STAE)交换膜色谱介质,可用于高盐环境下单克隆抗体的高效精制。自制STAE膜色谱介质在含有150 mM NaCl的缓冲液中可以保留75%的蛋白吸附容量。另外,Langmuir等温吸附模型比Freundlich吸附模型更适合模拟蛋白在STAE膜表面的吸附。当流速为10-100 膜体积(MV)/min时,膜色谱介质的蛋白吸附容量基本不受流速的影响。而且所制备STAE膜色谱介质的机械性能、稳定性、分离效率和重复使用性均优于商业化产品。(3)以疏水膜上的PDA为平台,可实现阴离子交换配基的快速匹配,构建适用于特定分离体系的膜色谱介质。同时通过优化流速、洗脱盐浓度、缓冲液pH、进样体积和配基密度等条件,实现了一步法从血浆沉淀IV中分离得到纯度为94.6%的α1-抗胰蛋白酶(AAT),其质量回收率和活性收率分别为94.2%和96.6%,该纯化效果优于采用商业化产品获得的结果以及文献报道结果。本研究建立了一种通过设计膜色谱介质实现复杂料液中快速纯化高纯度生物药物的新方法。(4)采用自制的阴离子交换膜色谱介质和金属螯合膜色谱介质,对发酵料液中的漆酶进行同步纯化和固定化以构建酶膜反应器。两种膜色谱介质上固定的漆酶均具有较高的纯度。膜表面漆酶的活力和比活力不受固定化过程中操作流速的影响,流穿式固定化模式比传统的浸泡模式更高效。所制备的酶膜反应器具有较好的稳定性、可重复性和良好的双酚A(BPA)去除能力。由于金属离子与漆酶结合更牢固,因此处理BPA料液时,用金属螯合膜色谱介质构建的酶膜反应器没有蛋白泄漏。研究发现当堆叠四层膜处理(BPA)时,用金属螯合膜色谱介质构建的酶膜反应器对BPA的去除率可提高至99.3%;当料液处理通量提高至50 L/m2 h时,BPA的去除效率(473.0 mg/m2 h)高于文献中报道的结果

语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/24316
专题研究所(批量导入)
推荐引用方式
GB/T 7714
樊金鑫. 基于聚多巴胺功能化的膜色谱介质制备及其在蛋白分离中的应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2017.
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