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组合固定化蛋白酶水解酵母蛋白制备抗氧化多肽
Alternative TitlePreparation of Antioxidant Peptides from Yeast Proteins by Combined Immobilized Proteases
刁文锦
Subtype硕士
Thesis Advisor王平 ; 张羽飞 ; 张松平
2013-05-01
Degree Grantor中国科学院研究生院
Degree Discipline生物化工
Keyword抗氧化肽   酵母蛋白   固定化木瓜蛋白酶   固定化酸性蛋白酶   超大孔pgma微球   介孔聚苯乙烯微球
Abstract以工业废弃的酵母细胞为原料提取酵母蛋白,并利用蛋白酶的水解作用制备抗氧化肽是将发酵行业废弃物转化为高附加值产品的理想途径,对于底物蛋白质水解程度的有效控制是保证产物具有高抗氧化活性的关键,将蛋白酶固定化后再用于酶解过程是实现蛋白质可控水解的有效途径,但传统载体固定化蛋白酶后,大分子蛋白质底物在载体中的扩散受到严重限制,导致固定化酶活力收率极低。本课题以酵母蛋白为原料,以酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶为研究对象,选用超大孔微球固定化蛋白酶,进行酵母蛋白的可控水解制备抗氧化肽。 (1)采用超声破碎-乙醇沉淀法提取酵母蛋白,确定出了酵母蛋白最佳提取条件:超声功率120 W、破碎所用缓冲液pH为7.5、超声时间15 min;将缓冲液pH调为7.0后,采用用70%浓度的乙醇对蛋白进行沉淀。此条件下,酵母蛋白提取率为48.84%。使用Glycine-SDS-PAGE电泳分离酵母蛋白,测得其分子量分布在24-81.6 kD之间,且几乎为连续分布。 (2)酵母蛋白经游离酸性蛋白酶水解后,最高抗氧化活性为108 μmol TE/g,酵母蛋白经游离木瓜蛋白酶水解后,最高抗氧化活性为82.8 μmol TE/g,远高于一般食物中的抗氧化值。将两种酶先后加入体系中催化酵母蛋白水解高于单一的蛋白酶水解产物的抗氧化活性,并且高于两种酶同时加入的水解速率和水解物抗氧化活性。 (3)采用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)超大孔微球对木瓜蛋白酶进行了固定化:酶浓度1.5 mg/mL,载体量1mg,固定化pH 8.0,固定化温度4 ℃,固定化时间24 h。对固定化木瓜蛋白酶的催化条件进行了优化,在pH 5.5、30 ℃、摇床转速150 rpm下进行反应最为合适。木瓜蛋白酶的最高固定化量为63.9 μg/mg载体,固定化木瓜蛋白酶的比活力为156.5 U/mg,活力回收率81.6%。固定化后热稳定性、重复使用性、储存稳定性明显提高。 (4)固定化酸性蛋白酶采用聚苯乙烯(PST)介孔微球吸附固定化后,进行戊二醛交联处理加强酶在载体上的吸附。酶浓度0.4 mg/mL,载体量1 mg,固定化pH 3.0,固定化温度25 ℃,固定化时间24 h,戊二醛浓度0.5%,交联时间3 h时,固定化量为338 μg/mg载体。对固定化酸性蛋白酶的催化条件进行了优化,其优化结果为:pH 3.0、30 ℃、摇床转速180 rpm,在此条件下固定化酸性蛋白酶的比活力39.34 U/mg,活力回收为38.0%,固定化后热稳定性、重复使用性具有明显提高。 (5)考察了水解度与抗氧化活性的关系。木瓜蛋白酶水解酵母蛋白进行水解时,抗氧化活性在随着水解度的增加先上升后缓慢下降,在水解度为3.5%时最高(游离木瓜酶和固定化木瓜蛋白酶规律相同);水解度3.5%的木瓜蛋白酶水解产物经酸性蛋白酶水解后,抗氧化活性在随着水解度的增加先上升后缓慢下降,在水解度为12.5%时最高(游离酸性蛋白酶和固定化酸性蛋白酶规律相同)。使用组合的固定化蛋白酶制备抗氧化活性最高的多肽,先使用固定化木瓜蛋白酶催化至水解时间为56min,再将其产物使用固定化酸性蛋白酶水解4h,抗氧化活性为最高抗氧化活性142μmol TE/g
Other AbstractPreparing bioactive peptides from waste protein is a beneficial way to realize waste recycling. In this paper, we prepare value-added antioxidant peptides using industrial waste yeast as the protein resource through proteases catalyzed hydrolyzation. In preparation of antioxidant peptides by enzymatic hydrolyzation, the degree of hydrolyzation (DH) is a key parameter. Using immobilized enzyme will make to controlling of hydrolysis time for protein hydrolyzation easily, yet the traditional carriers for enzyme immoblization is a barrier to the diffusion of large size protein substrate, leading to low specific activity of immobilized proteases. In this paper, we aim at immobilizing proteases onto gigaporous microspheres to realize the controllable hydrolyzation of yeast protein with acidic protease (AP) and papain (PP) as catalysts.
Pages99
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/8271
Collection研究所(批量导入)
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GB/T 7714
刁文锦. 组合固定化蛋白酶水解酵母蛋白制备抗氧化多肽[D]. 中国科学院研究生院,2013.
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