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离子液体在青霉素G酰化酶固定化中的应用基础研究
作者: 周华从
学位类别: 博士
答辩日期: 2013-05-01
授予单位: 中国科学院研究生院
导师: 刘会洲
关键词: 离子液体  ;  青霉素G酰化酶  ;  酶固定化  ;  超顺磁性
其他题名: Basic and Applied Application of Ionic Liquids in Penicillin G Acylase
学位专业: 化学工艺
中文摘要: 离子液体(ionic liquids, ILs)具有低的蒸汽压、良好的溶解能力及可调的结构等独特性质,在酶催化领域可以用作反应介质,表现出优于传统有机溶剂的特性。但直接将离子液体用作反应介质,对有些酶而言存在着酶活性低甚至完全失活、ILs黏度高、用量大及不易回收等缺点。负载化离子液体(supported ionic liquids, SILs)是通过物理或化学过程将离子液体负载到固体介质表面或内部,能够增强酶的活性或稳定性、降低离子液体用量及黏度、实现离子液体回收利用。本论文从离子液体种类的选择、负载量调控、浓度及固定化方式优化等方面入手,开展了离子液体在青霉素G酰化酶(penicillin G acylase, PGA)固定化中应用的研究。 制备了超顺磁性SiO2纳米颗粒负载化离子液体(Fe3O4/SiO2-ILs-X,X = Cl-, BF4-, PF6-和Tf2N-),比饱和磁强度27.47 emu/(g SiO2),平均粒径210 nm。离子液体以共价键形式负载到载体表面。综合考虑酶固定化效果的多种指标,如酶负载量、比活、固定效率及酶的稳定性,亲水性负载化离子液体在固定PGA时优于疏水性离子液体。PGA在负载化离子液体表面的吸附过程符合Pseudo-second-order动力学模型;负载化离子液体对PGA的吸附速率要快于没有经过离子液体修饰的载体(如裸露的Fe3O4/SiO2)。游离PGA最适pH值为9左右,而固定化PGA最适pH值为7左右。固定化PGA对温度的响应性与离子液体种类有关。负载化离子液体固定化PGA在循环使用9次之后保留70 %的初始活性,比没有经过离子液体修饰的载体循环使用性能(40 %)提高了1.8倍。 通过载体粒径调节法和条件控制法,对负载化离子液体制备过程中如何调控离子液体负载量进行了研究。结果表明控制载体粒径能够调控离子液体负载量,但该法仅适用于粒径具有可调性的载体。在制备负载化离子液体过程中,溶剂法和溶胶凝胶法都能够成功调控离子液体负载量。在溶剂法中,三乙氧基硅烷功能化离子液体在SiO2表面的负载量在不同介质中有以下顺序:乙醇 < 乙醇/水 < THF/水 < 丙酮 < 水 < [BMIM]Cl/水 < THF < 甲苯,其中混合溶剂的体积比为1:1。在溶胶凝胶法中,通过控制反应时间0 ~ 48 h,能够将离子液体负载量在0 ~ 0.17 mmol/(g SiO2)范围内调控。溶胶-凝胶法比溶剂法有更高的离子液体负载量和更宽的调控范围。载体的zeta电位和等电点均随着离子液体负载量的升高而增大。随着离子液体负载量的升高,PGA的固定量逐渐下降,但固定化PGA的表观活性和比活均升高;固定化PGA的循环使用性同时受到离子液体负载量和载体形貌的影响。 为了进一步提高PGA固定化后的活性和固定化效率,开发出离子液体在酶催化过程中新的使用形式,即海藻酸钙空心微囊包埋离子液体-PGA复合物。实验首先对PGA相容性的离子液体进行筛选,结果表明阳离子上带有长的烷基链(如C10)、乙酸根或者阴离子为FeCl4-的离子液体对PGA活性有强的破坏作用。[BMIM]Br在不同浓度下能够将PGA活性提高约1.1 ~ 1.3倍。用[BMIM]Br对PGA进行修饰,形成[BMIM]Br-PGA复合物,然后利用海藻酸钙空心微囊对[BMIM]Br-PGA复合物进行包埋固定化。结果表明无论是在游离形式下还是在包埋固定化下PGA的活性都得到提高。微囊直径约2 ~ 3 mm,壁厚约0.1 ~ 0.3 mm。PGA的包埋率近100 %,克服了吸附法固定化中PGA固定率低和比活下降的问题。与负载化离子液体吸附法固定PGA相比,海藻酸钙空心微囊包埋离子液体-PGA复合物操作过程更为简单,PGA固定后活性和固定化效率更高,因此更有应用前景。 通过对[BMIM]Br-PGA体系进行紫外光谱、荧光光谱、zeta电位和蛋白质胶团大小等表征和分析,探索了离子液体对PGA活性影响的内在机制。随着[BMIM]Br-PGA体系中[BMIM]Br浓度的升高,PGA分子中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸)的紫外吸收强度逐渐下降且发生位移,而它们的荧光强度则在PGA完全失去活性时达到最大。PGA表面电位总体变化趋势是随着[BMIM]Br的升高而降低。随着体系中[BMIM]Br浓度的升高,PGA溶液中蛋白质胶团粒径逐渐增大。由此推测,离子液体通过分子和胶团两个层次来影响PGA活性:在分子层次上,与PGA表面芳香族氨基酸残基相互作用,改变PGA构象和表面性质;在胶团层次上,高浓度离子液体引发PGA溶液中蛋白质团聚,使得胶团粒径增大,进而影响其催化性能。本论文为离子液体进一步的工业应用提供了基础数据。
英文摘要: Ionic liquids (ILs) possess many unique properties including low vapor pressure, excellent solvation and tunable structures, etc. ILs can be used as the media of biocatalysis reactions with lots of advantages over traditional organic solvents. However, the direct use of ILs as media has some shortbacks, such as low or no activity for certain enzymes, high viscosity, large amounts of usage, and difficulties in recycling, etc. Supported ILs (SILs) is a novel way of applying ILs by immobilizing ILs onto or into the solid supports. SILs could strengthen the activity or stability of enzymes, decrease the usage and viscosity of ILs and fulfill the recycling of ILs. This thesis develops the new application of ILs in penicillin G acylase (PGA) from the point of IL types, tuning of loadings, and optimization of IL concentrations and supporting routes. Superparamagnetic silica nanoparticles supported ILs (Fe3O4/SiO2-X, X = Cl-, BF4-, PF6- and Tf2N-) were prepared with the saturation magnetization of 27.47 emu/(g silicas) and average sizes of 210 nm. ILs were immobilized on the support via covalent bonds. The hydrophilic ILs were superior to the hydrophobic ones with consideration of the amount of protein loading, specific activity, immobilization yield and stability of enzymes. The adsorption of PGA onto SILs followed the Pseudo-second-order kinetic model; the adsorption rate onto SILs was higher than that of supports without ILs such as naked Fe3O4/SiO2. The optimal pH value for native PGA was ~9.0, while it shifted to 7.0 for immobilized PGA.
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/8286
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周华从. 离子液体在青霉素G酰化酶固定化中的应用基础研究[D]. 中国科学院研究生院. 2013.
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