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蛋白质的体外折叠及层析法复性的研究
谷振宇
Subtype博士
Thesis Advisor苏志国
2001-04-01
Degree Grantor中国科学院研究生院
Place of Conferral北京
Degree Discipline生物化工
Abstract蛋白质的体外折叠复性始终是生物下游工程的瓶颈,尤其是对于包涵体蛋白质,复性后一般很难在高浓度下得到高活性回收率。针对这些问题本文分别以模型蛋白质溶菌酶和包涵体蛋白质单链抗体融合蛋白scFv57P为目标蛋白质,系统地研究了两者体外折叠的特点,并对蛋白质的层析复性进行了重点研究,进而发展了适合于包涵体分离、纯化和变性蛋白质复性的新型层析技术。论文首先以溶菌酶为模型蛋白质,比较了常规的稀释复性和凝胶过滤层析复性在溶菌酶复性中的应用。在稀释复性中考察了不同原料液处理过程对于活性回收率的影响,并总结出先酸化再脱除还原剂DTT是最适合于稀释复性的原料液处理过程。随后通过天然蛋白质与复性蛋白质在凝胶过滤层析中层析谱图的比较说明了凝胶过滤层析促进蛋白质复性的原理和优越性。论文的一个主要贡献是根据凝胶过滤层析的特点,发展了一种新型的尿素浓度梯度凝胶过滤层析复性蛋白质的方法。该方法根据大分子蛋白质在凝胶过滤中向下移动速度比小分子变性剂快得多的原理,利用含高浓度变性剂和不含变性剂的两种缓冲液在凝胶过滤层析柱中先形成了一个至上而下的变性剂梯度,这样当变性蛋白质加入柱中开始复性时,它将沿着这个预先形成的变性剂梯度从高浓度变性剂中向复性缓冲液中移动,从而实现了变性剂浓度的线性逐步脱除。在与常用复性方法的比较中,这种方法在模型蛋白质溶菌酶的复性实验中初步显示出了一定的优越性。可以在高变性蛋白质浓度下获得高的活性回收率。对于各种影响因素如:尿素浓度梯度长度、尿素浓度和洗脱流速也进行了考察。采用优化的复性条件可以在最终蛋白质浓度为2一3 mg/ml时活性回收率可达到90%以上,而用传统方法在同样缓冲液条件下只能得到540la左右的回收率。论文的另一创新之处是根据包涵体蛋白质比其它杂质蛋白质分子尺寸大得多的原理,通过选择适当的凝胶过滤介质,对包涵体蛋白质scFv57P进行了纯化,并实现了包涵体分离与包涵体洗涤的过程集成。用一步凝胶过滤代替了反复的离心与洗涤过程。通过一步操作即可在40 min内得到与反复离心洗涤同样纯度的包涵体蛋白质scFv57P,在SDS一PAGE电泳中表现为单一带。同时证明在原料破碎液中加入溶菌酶是非常必要的。在对 scFv57P复性的研究中,先用正交实验得到对于scFv57P最佳溶液稀释复性的pH及温度。并考察了各种复性聚集抑制剂、氧化还原对及不同缓冲液对scFv57P复性的影响,综合各种因素得到最佳的复性缓冲液组成:20 mmolhTris C pH =7.5)1 mmolll EDTA,含2 molll尿素及摩尔比为1/1的GSSG与0在此基础上用脉冲滴加复性对普通稀释复性进行了改进。在溶液复性的基础上,根据重组scFv57P蛋白C未端具有b一histine tag的特点,发展了金属鳌合层析C IMAC)复性,并同样在IMAC上实现了尿素的线性脱除,证明线性脱除尿素可以促进scFv57P的正确折叠从而提高它的活性回收率。将前面发展的新型尿素浓度梯度凝胶过滤复性应用于scFv57P的复性过程中,并对复性过程进行了优化,以此优化条件可以在终浓度为0.1 mglm佩时获得40%的活性回收率。为了研究尿素浓度梯度促进蛋白质复性的机理,对两种目标蛋白质的复性动力学方程进行了研究。动力学研究的结果表明尿素浓度升高时对于聚集反应的抑制程度增大,并结合复性的动力学过程说明了尿素浓度梯度促进复性的原理。为了对两种蛋白质复性的不同之处有更好的了解还对两者的复性动力学岸数加以了比较。论文的最后在单独尿素浓度梯度凝胶过滤复性的基础上,结合稀释复性件原料液处理的原理,为了抑制复性过程中错误S一S键的形成,发展了pH和尿素浓度梯度联合凝胶过滤复性的新方法。并分别将其用于scFv57P和溶菌配的复性中,通过结果比较发现这种方法对于scFv57P这样折叠较慢的蛋白质的复性有促进作用的。用此方法可以获得超过50%的活性回收率。复性后的scFv57P用亲和层析进行了纯化,将活性的与非活性的scFv57P区分开来。最后将各种复性方法进行了综合比较以得到一些有关蛋白质复性方法的普遍规律。
Pages148
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/8311
Collection研究所(批量导入)
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GB/T 7714
谷振宇. 蛋白质的体外折叠及层析法复性的研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2001.
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